Μεθοδολογία δειγματοληψιών σε μεταβατικά Υδατικά Σώματα

Χλωροφύλλη-α

Οι δειγματοληψίες πραγματοποιούνται στην επιφάνεια (20-50 cm βάθος). Η συλλογή του θαλασσινού νερού γίνεται χειρωνακτικά σε πλαστικές φιάλες του ενός λίτρου.

Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης χλωροφύλλης-α, σε κάθε δείγμα, πραγματοποιείται διήθηση ορισμένου όγκου νερού σε ηθμούς (φίλτρα) WhatmanGF/F. Τα φίλτρα καταψύχονται σε θερμοκρασία -20 ⁰C έως ότου αναλυθούν στο εργαστήριο.

Στα 100 ml νερού που προορίζονται για τη μικροσκοπική ανάλυση της σύνθεσης του φυτοπλαγκτού, προστίθεται αμέσως 1 ml ιωδιούχου διαλύματος Lugol και τα δείγματα διατηρούνται σε ψυγείο (4 ⁰C) έως ότου αναλυθούν στο εργαστήριο.

Η χλωροφύλλη–α (Chl α) προσδιορίζεται με φθορισμόμετροTURNERTD 700 κατά Holm-Hansen et al. (1965)[1] και η σύνθεση των πληθυσμών φυτοπλαγκτού κατά Utermöhl (1958)[2],σε ανάστροφο μικροσκόπιο (OLYMPUSIX70), εξοπλισμένο με σύστημα ανάλυσης εικόνας ImagePro.

Η ανάλυση, σε ό,τι αφορά στο φυτοπλαγκτόν, γίνεται σε ειδικούς θαλαμίσκους καθίζησης των 25 ml, όπου κάθε υπο-δείγμα παραμένει τουλάχιστον για 24 ώρες και κατόπιν εξετάζεται σε ανάστροφο μικροσκόπιο. Τα δείγματα αναλύονται ποιοτικά (είδος κυττάρων ανά δείγμα) και ποσοτικά (αριθμός κυττάρων ανά λίτρο νερού, κυττ/l), για τον προσδιορισμό των κυριοτέρων φυτοπλαγκτονικών ομάδων (διάτομα,  δινομαστιγωτά, κοκκολιθοφόρα, κυανοφύκη, μαστιγωτά >5 μm, κρυπτοφύκη,  πρασινοφύκη, ευγληνοφύκη) και της παρουσίας κυττάρων <5 μm, των οποίων η καταμέτρηση δεν είναι ακριβής με την παρούσα μεθοδολογία. Σε κάθε σταθμό επισημαίνεται η παρουσία δυνητικά τοξικών μορφών.

Η αναγνώριση των φυτοπλαγκτονικών ειδών γίνεται σύμφωνα με τους Hoppenrath et al. (2009)[3], Avancini et al. (2006)[4], Bernard –Therriault et al. (1999)[5], Lassus (1980)[6], Rampi & Bernhard (1981)[7], Tomas(1997)[8].

[1] Holm-Hansen Osmund, Carl J. Lorenzen, Robert W. Holmes, John D. H. Strickland, Fluorometric Determination of Chlorophyll, ICES Journal of Marine Science, Volume 30, Issue 1, December 1965, Pages 3–15. https://doi.org/10.1093/icesjms/30.1.3

[2] Utermohl, H., (1958). Zurvervollkommnung der quantitativen Phytoplankton Methodik. Mitt. Int. Ver. Theor. Angew. Limnol., 9: 1-38. https://doi.org/10.1080/05384680.1958.11904091

[3] Hoppenrath, M., Elbrächter, M., &Drebes, G. (2009). Marine phytoplankton: Selected Microphytoplankton Species from the North Sea Around Helgoland and Sylt.  E. Schweitzerbart’sche Publishers, Stuttgart, Germany, 264 pp.

[4] Avancini, M., Cicero, A.M., Di Girolamo, I., Innamorati, M., Magaletti, E., and SertorioZunini T. (2006) Guida al riconoscimento del plancton dei mari italiani, Vol. I – Fitoplancton. Ministero dell’Ambiente e dellaTutela delTerritorio e del Mare – ICRAM, Roma, 503 pp.

[5] Bérard-Therriault, L., Poulin, M. and Bossé, L. (1999). Guide d’identification du phytoplancton marin de l’estuaire et du Golfe du Saint-Laurent incluantégalementcertainsprotozoaires. Publication Spéciale Canadienne des Sciences Halieutiques et Aquatiques, 128: 1-387.

[6] Lassus, P., (1980). Mise a four des donees sur les organismes repousables d’eau rouge. Extension an micro-plancton produisant des toxins. Institut scientifique et technique des pesces maritimes, 137pp.

[7] Rampi, L. & Bernhard, M., (1981). Chiave per la determinazione delle coccolithoforidee mediterranee. Comitato Nazionale Energia Nucleare, CNEN-RT/BIO(81)13, 98pp.

[8] Tomas C. (Editor) (1997). Identifying Marine Phytoplankton. Academic Press, San Diego. 858 pages.

Σε κάθε λιμνοθάλασσα πραγματοποιείται αναγνώριση και χαρτογράφηση (κατά προσέγγιση) των κύριων τύπων ενδιαιτημάτων (1- βυθισμένα αγγειόσπερμα ή αγγειόσπερμα με μακροφύκη-κυανοβακτήρια, 2- μακροφύκη-κυανοβακτήρια, 3- βυθός χωρίς βλάστηση) και της έκτασης που αυτά καταλαμβάνουν. Από τα δύο ενδιαιτήματα με βλάστηση (1, 2) επιλέγεται ένα ή και τα δύο (κρίση εμπειρογνώμονα) στα οποία θα πραγματοποιηθούν οι δειγματοληψίες. Σε κάθε ενδιαίτημα επιλέγονται ένας ή δύο σταθμοί δειγματοληψίας (site: 15 x 15 m), στον οποίο ή στους οποίους η κάλυψη της βενθικής βλάστησης είναι μεγαλύτερη από 10%. Από κάθε σταθμό, ο οποίος βρίσκεται σε απόσταση 100-1000 μέτρα από τον άλλον, συλλέγονται 4-5 τυχαία δείγματα (8-10 σύνολο) για την ανάλυση της βενθικής χλωρίδας.

Τα δείγματα των βενθικών μακροφύτων συλλέγονται από τον πυθμένα των μεταβατικών υδάτων σε βάθη από 0.2 μέχρι 1.5 m από την κατώτατη στάθμη του νερού. Η δειγματοληψία είναι συμβατική (“καταστροφική” δειγματοληψία), με τη χρήση πυρηνο-δειγματολήπτη (Box-corer) επιφάνειας 0.0289 cm² (17 cm x 17 cm x 15 cm, μήκος x πλάτος x ύψος) και πραγματοποιείται μεταξύ του τέλους της άνοιξης και του μέσου του καλοκαιριού κάθε έτους. Ένα επιπλέον αντιπροσωπευτικό δείγμα, σε μια θέση δειγματοληψίας, συλλέγεται για τον προσδιορισμό οργανικού άνθρακα και ολικού αζώτου στο ίζημα με στοιχειακό αναλυτή CHN. Όλα τα δείγματα που συλλέγονται στο πεδίο συντηρούνται σε δοχεία που περιέχουν διάλυμα θαλασσινού νερού και φορμόλης 4%, έως την περαιτέρω μεταφορά και επεξεργασία τους στο Εργαστήριο.

Η μελέτη και αναγνώριση των ταξινομικών μονάδων (taxa) των βενθικών μακροφύτων πραγματοποιείται στο εργαστήριο με χρήση στερεοσκοπίου και μικροσκοπίου σε επίπεδο λειτουργικής ομάδας και σε επίπεδο είδους. Όπου δεν είναι δυνατή η αναγνώριση σε επίπεδο είδους, τα μακροφύκη αναγνωρίζονται σε επίπεδο γένους. Η ονοματολογία και η συστηματική κατάταξη των μακροφυκών πραγματοποιείται σύμφωνα με τη βάση δεδομένων algaebase: www.algaebase.org.

Η μέτρηση της κάλυψης (coverage) του υποστρώματος από τα φυτά γίνεται σύμφωνα με τους Orfanidis et al. 2008[1]. Γίνεται η διαλογή των φυτών σε κάθε δείγμα και η μερική επιφάνεια κάλυψης κάθε είδους (Ri) σε κάθετη προβολή ποσοτικοποιείται ως επί τοις εκατό κάλυψη στο σύνολο της επιφάνειας δειγματοληψίας. Για τα είδη με ασήμαντη κάλυψη θα δίνεται η συμβατική τιμή 0.01%. Η ολική κάλυψη (ΣRi) συνήθως υπερβαίνει το 100%, λόγω της παρουσίας πολλών ορόφων βλάστησης (όροφος αγγειοσπέρμων, θαμνώδης όροφος και επίφυτα).

[1] Orfanidis S., Pinna M., Sabetta L., Stamatis N., Nakou K. (2008). Variation of structural and functional metrics in macrophyte communities within two habitats of eastern Mediterranean coastal lagoons: natural versus human effects. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems 18: S45-S61. https://doi.org/10.1002/aqc.957

Γίνεται συλλογή δειγμάτων ζωοβένθους με δειγματολήπτη βυθού στο μαλακό υπόστρωμα των μεταβατικών υδάτων. Η δειγματοληψία γίνεται με πλωτό μέσο. Σε κάθε σταθμό συλλέγονται δύο επαναληπτικά δείγματα για την ανάλυση της βενθικής πανίδας. Ένα επιπλέον δείγμα συλλέγεται σε κάθε σταθμό για προσδιορισμό οργανικού άνθρακα και ολικού αζώτου στο ίζημα με στοιχειακό αναλυτή CHNS FLASH 2000 Thermo Scientific. Τα δείγματα κοσκινίζονται επί τόπου με κόσκινο ανοίγματος 1 mm και τοποθετούνται σε πλαστικά δοχεία με διάλυμα φορμόλης χρωματισμένο με Rose Bengal. Μετά τις δειγματοληψίες γίνεται διαλογή (sorting) των ζωντανών οργανισμών στο εργαστήριο. Το επόμενο στάδιο αφορά τον προσδιορισμό των οργανισμών (συνήθως σε επίπεδο είδους για τις κύριες ζωοβενθικές ομάδες).

Τα δείγματα της ιχθυοπανίδας (ιχθυοκοινότητες) συλλέγονται με τη χρήση συρόμενου αλιευτικού εργαλείου (πεζόγριπος) που έχει μήκος 10 m, ύψος 2 m και άνοιγμα ματιού στα 2 mm. Οι δειγματοληψίες πραγματοποιούνται μία φορά το χρόνο κατά την περίοδο άνοιξη – φθινόπωρο (τροποποίηση Franco et al., 2009[1]). Δειγματοληψίες γίνονται τόσο σε σταθμούς με βλάστηση όσο και χωρίς βλάστηση (λασπώδες, αμμώδες, βραχώδες, κλπ υπόστρωμα), τόσο στο εσωτερικό όσο και κοντά στο στόμιο επικοινωνίας με τη θάλασσα, σύμφωνα με τη μεθοδολογία που προτείνεται από τους Franco et al. (2006)[2] και Franco et al.[3]. Στόχος είναι η σύλληψη όσο το δυνατόν περισσότερων ειδών που διαβιούν σε διαφορετικά ενδιαιτήματα. Σε κάθε σταθμό γίνονται κατά το δυνατόν τρεις επαναλήψεις- σύρσεις 30-50 m, οι οποίες καλύπτουν συνολική επιφάνεια περίπου 250 m².

Κατά τη διάρκεια των δειγματοληψιών, η ταξινόμηση των ψαριών γίνεται κατά είδος και σε κλάσεις μεγέθους. Αντιπροσωπευτικά δείγματα ψαριών συντηρούνται σε διάλυμα φορμόλης 6%, ώστε να είναι δυνατή η επιβεβαίωση της σωστής ταυτοποίησης των ειδών. Για κάθε περιοχή υπολογίζεται η συνολική σχετική αφθονία (Total Relative Abundance), χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της σύλληψης ανά μονάδα προσπάθειας (Catches per Unit Effort, CPUE, Gulland, 1964[4]).

[1] Franco A., Torricelli P. & Franzoi P., (2009). A habitat-specific fish-based approach to assess the ecological status of Mediterranean coastal lagoons. Marine Pollution Bulletin, 58(11): 1704-17. https://doi.org/10.1016/j.marpolbul.2009.06.016

[2] Franco, A., Franzoi, P., Malavasi, S., Riccato, F., & Torricelli, P., (2006). Use of shallow water habitats by fish assemblages in a Mediterranean coastal lagoon. Estuarine, Coastal and Shelf Science, 66: 67–83. https://doi.org/10.1016/j.ecss.2005.07.020

[3] Franco A, PÈrez-Ruzafa A, Drouineau H, Franzoi P, Koutrakis ET, Lepage M, Verdiell-Cubedo D, Bouchoucha M, LÛpez-Capel A, Riccato F, Sapounidis A, Marcos C, Oliva-Paterna FJ, Torralva-Forero M, Torricelli P. (2012). Assessment of fish assemblages in coastal lagoon habitats: Effect of sampling method. Estuarine, Coastal and Shelf Scienc 112, 115-125. https://doi.org/10.1016/j.ecss.2011.08.015

[4] Gulland, J. A., (1964). Catches per unit effort as a measure of abundance. Rapports et Procès-verbaux des réunions Conseil Internationale pour l’exploration de la Mer, 155: 739-751.

Η συλλογή αυτών των παραμέτρων (θερμοκρασία, αλατότητα, θολερότητα και διαλυμένο οξυγόνο / μετρημένο ηλεκτρονικά) γίνεται με φορητά όργανα στο πεδίο. Η θερμοκρασία αναφέρεται σε βαθμούς Κελσίου και η αλατότητα σε επί τοις χιλίοις περιεκτικότητα σε αλάτι. Η μέτρηση της θολερότητας εκφράζεται μέσω του υπολογισμού του συντελεστή ‘εξασθένησης’ (attenuation coefficient) της ακτινοβολίας PAR ή με τη χρήση δίσκου Secchi. Στα μεταβατικά υδάτινα σώματα, η αγωγιμότητα, η αλατότητα, η θερμοκρασία και το pH θα μετρηθούν στο πεδίο με χρήση πολυαισθητήρα YSI 600QS.

Το διαλυμένο οξυγόνο μετράται επί τόπου στο πεδίο, με χρήση πολυαισθητήρα YSI 600QS.

Οι αναλύσεις για τον προσδιορισμό των νιτρικών, νιτρωδών και πυριτικών αλάτων γίνονται στη διαπιστευμένη κατά ISO 17025 εργαστηριακή μονάδα θρεπτικών αλάτων του βιογεωχημικού εργαστηρίου του ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε. με αυτόματο αναλυτή θρεπτικών αλάτων BRAN + LUEBBE autoanalyzer III, σύμφωνα με πρότυπες μεθόδους (Mullin & Rilley, 1955[1] για τα πυριτικά, Stickland & Parsons, 1968[2] για νιτρώδη – νιτρικά και Murphy & Riley, 1962[3] για τα φωσφορικά). Τα όρια ποσοτικοποίησης των μεθόδων είναι 0.025 μΜ για τα νιτρώδη άλατα, 0.154 μΜ για το άθροισμα νιτρικών και νιτρωδών αλάτων, 0.102 μΜ για τα αμμωνιακά άλατα και 0.274 μΜ για τα πυριτικά άλατα. Οι συγκεντρώσεις που προσδιορίζονται και είναι μικρότερες των ορίων ποσοτικοποίησης αναφέρονται ως <LOQ.

Τα αμμωνιακά άλατα προσδιορίζονται μετά τη δειγματοληψία σε ειδικά φιαλίδια, με φασματοφωτόμετρο Perkin-Elmer UV/VIS (Lambda 25Lambda), σύμφωνα με πρότυπες μεθόδους ανάλυσης (Κoroleff, 1970[4]).

[1] Mullin, J.B. & Riley, J.P., (1955). The colorimetric determination of silicate with special reference to sea and natural waters. Anal. Chim. Acta, 12: 162-176. https://doi.org/10.1016/S0003-2670(00)87825-3

[2] Strickland, J.D.H & Parsons, T.R., (1968). A practical handbook of sea water analysis. Bull. Fish. Res. Bd. Canada, 167:310p.

[3] Murphy, J. & Riley, J. P., (1962). A modified single solution method for phosphate in natural waters. Anal. Chim. Acta, 12: 162-176.

[4] Koroleff, F., (1970). Revised version of “Direct determination of ammonia in natural waters as indophenol blue”. Int. Con. Explor. Sea C. M. 1969/ C:9 ICES information on techniques and methods for sea water analysis. Interlab. Rep., No 3, 19-22.

Ο προσδιορισμός του ολικού αζώτου (TN) και του ολικού φωσφόρου (ΤΡ) γίνεται με τη μέθοδο της υγρής χημικής οξείδωσης (wet chemical oxidation method, WCO) όπως περιγράφεται από τους Pujo-Pay & Raimbault (1994)[1] και Raimbault et al.(1999)[2].

Για τον προσδιορισμό του ΤΝ, 40 ml νερού συλλέγονται σε Pyrex φιαλίδια (Duran Schott) των 50 ml με κατάλληλο βιδωτό καπάκι, ενώ για τον προσδιορισμό του ΤΡ συλλέγονται 20 ml θαλασσινού νερού σε κατάλληλα φιαλίδια από Teflon. Τα δείγματα διατηρούνται μέχρι την ανάλυσή τους σε -20 °C. Όλα τα φιαλίδια που χρησιμοποιούνται για τη συλλογή/φύλαξη των δειγμάτων έχουν υποστεί προκατεργασία καθαρισμού δύο σταδίων που περιλαμβάνει την πλήρωση των φιαλιδίων με HCl 10% για 24 ώρες, ξέπλυμα και εν συνεχεία προληπτική οξείδωση για την απομάκρυνση ιχνών οργανικής ύλης. Το περιεχόμενο των φιαλιδίων απορρίπτεται τη στιγμή της δειγματοληψίας και τα φιαλίδια ξεπλένονται πολύ καλά με το δείγμα.

Σύμφωνα με την αρχή της μεθόδου επιτυγχάνεται οξείδωση των αζωτούχων και φωσφορούχων ενώσεων και μετατροπή τους σε ανόργανα διαλυτά νιτρικά και φωσφορικά άλατα, αντίστοιχα, οπότε τα δείγματα μετά τη διαδικασία της υγρής χημικής οξείδωσης μετρούνται σε αυτόματο αναλυτή θρεπτικών αλάτων BRAN+LUEBBE autoanalyzer III, σύμφωνα με τις μεθόδους που αναφέρονται παραπάνω για νιτρικά+νιτρώδη και φωσφορικά αντίστοιχα.

[1] Pujo-Pay, M. & P. Raimbault, (1994). Improvement of the wet-oxidation procedure for simultaneous determination of particulate organic nitrogen and phosphorus collected on filters. Mar. Ecol. Prog. Ser. 105, 203-207. https://pdfs.semanticscholar.org/2c64/17f3a2d0564b7917b60fb0ed79c1ceda7f2d.pdf

[2]Raimbault, P., W. Pouvesle, F. Diaz, N. Garcia, R. Sempere, (1999). Wet oxidation and automated colorimetry for simultaneous determination of organic carbon, nitrogen and phosphorus dissolved in seawater. Marine Chemistry 66, 161-169. https://doi.org/10.1016/S0304-4203(99)00038-9

Η ποσότητα του ολικού άνθρακα στα ιζήματα προσδιορίζεται με ένα CHN στοιχειακό αναλυτή τύπου EA-1108 της «Fisons Instruments» με την ακρίβεια της μεθόδου να καθορίζεται στο 5% της μετρηθείσας τιμής (Karageorgis et al., 2005)[1]. Ο επιμέρους οργανικός άνθρακας προσδιορίζεται σύμφωνα με την μέθοδο των Verardo et al. (1990)[2], με το όριο ανίχνευσης της μεθόδου να είναι 2.3 mg/g ανά 10 mg ξηρού δείγματος.

[1] Karageorgis A.P., Anagnostou C.L. & Kaberi H., 2005. Geochemistry and mineralogy of the NW Aegean Sea surface sediments: implications for river runoff and anthropogenic impacts. Applied Geochemistry, 20, 69-88. https://doi.org/10.1016/j.apgeochem.2004.07.008