Μεθοδολογία δειγματοληψιών σε παράκτια Υδατικά Σώματα

Χλωροφύλλη-α

Οι δειγματοληψίες πραγματοποιούνται σε πρότυπα βάθη, κατανεμημένα στην εύφωτη ζώνη της υδάτινης στήλης (2, 10, 20, 50, 75 και κοντά στον πυθμένα). Η συλλογή του θαλασσινού νερού γίνεται με δειγματολήπτες τύπου NISKIN, χωρητικότητας 10 λίτρων σε σύστημα αυτόματης δειγματοληψίας (Rosette sampler) της εταιρίας General Oceanics, προσαρμοσμένο σε αυτογραφικό όργανο CTD τύπου SBE-9. Για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων χλωροφύλλης-α ανά δείγμα, γίνεται διήθηση ορισμένου όγκου νερού (συνήθως 1.5 έως 2 λίτρα, ανάλογα με την τροφική κατάσταση κάθε σταθμού) με ηθμούς Whatman GF/F. Οι ηθμοί διατηρούνται σε ξηρό περιβάλλον στο σκοτάδι, σε θερμοκρασία 15 ^οC. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της χλωροφύλλης-α γίνεται με φθορισμόμετρο TURNER 00-AU-10, σύμφωνα με τη μέθοδο Holm-Hansen et al., 1965[1].

[1] Holm-Hansen O., Lorenzen C.J., Hormes R.N., Strickland J.D.H., (1965). Fluorometric determination of chlorophyll. J. Cons.perm. Int. Explor. Mer, 30: 3-15. https://doi.org/10.1093/icesjms/30.1.3

Τα δείγματα των μακροφυκών συλλέγονται με ελεύθερη κατάδυση από σχεδόν οριζόντιες επιφάνειες βράχων στην ανώτερη υποπαράλια ζώνη, δηλαδή σε βάθος 30-50 cm από την κατώτατη στάθμη της θάλασσας. Η δειγματοληψία είναι συμβατική (“καταστροφική” δειγματοληψία), δηλαδή πραγματοποιείται πλήρης αποψίλωση των μακροφυκών με χρήση καλεμιού και σφυριού από επιφάνεια 400 cm² (20 cm x 20 cm), η οποία θεωρείται γενικά ως η περισσότερο αντιπροσωπευτική ελάχιστη επιφάνεια δειγματοληψίας για τα μακροφύκη της Μεσογείου (Dhont & Coppejans, 1977[1]). Όλα τα δείγματα που συλλέγονται στο πεδίο συντηρούνται σε δοχεία που περιέχουν διάλυμα θαλασσινού νερού και φορμόλης 4%, έως την περαιτέρω μεταφορά και επεξεργασία τους στο Εργαστήριο Φυτοβένθους του ΕΛΚΕΘΕ.

Η μελέτη και αναγνώριση των ταξινομικών μονάδων (taxa) των μακροφυκών πραγματοποιείται στο εργαστήριο φυτοβένθους του ΕΛΚΕΘΕ, με χρήση στερεοσκοπίου WILD M5 και μικροσκοπίου LEITZ ORTHOLUX. Η ονοματολογία και η συστηματική κατάταξη των μακροφυκών πραγματοποιείται με βάση τους χλωριδικούς καταλόγους: Gallardo et al. (1993)[2] για τα χλωροφύκη, Ribera et al. (1992)[3] για τα φαιοφύκη, Athanasiadis (1987)[4] και Gómez-Garreta et al. (2001)[5] για τα ροδοφύκη. Υπόψη λαμβάνονται και οι όποιες επικαιροποιημένες αλλαγές των παραπάνω κατηγοριών αναφέρονται στη βάση δεδομένων algaebase: http://www.algaebase.org. Όπου η αναγνώριση σε επίπεδο είδους δεν είναι δυνατή, τα μακροφύκη αναγνωρίζονται σε επίπεδο γένους.

Η μέτρηση της κάλυψης (Coverage) του υποστρώματος από τα φυτά γίνεται σύμφωνα με τους Gomez-Garreta et al.[5]. Κατά τη διαδικασία αυτή, γίνεται η διαλογή των οργανισμών σε κάθε δείγμα και η μερική επιφάνεια κάλυψης κάθε είδους (Ri) σε κάθετη προβολή ποσοτικοποιείται ως επί τοις εκατό κάλυψη στο σύνολο της επιφάνειας δειγματοληψίας (4 cm² = 1% της επιφάνειας δειγματοληψίας). Για τα είδη με ασήμαντη κάλυψη  δίνεται η συμβατική τιμή 0.1%. Η ολική κάλυψη (ΣRi) συνήθως υπερβαίνει το 100%, λόγω της παρουσίας πολλών ορόφων βλάστησης (δενδρώδης όροφος, θαμνώδης όροφος και επίφυτα).

[1] Dhont F. & Coppejans E., (1977). Résultats d’une étude d’aire minima des peuplements algaux photophiles sur substrat rocheux à Port-Cros et à Banyuls (France). Rapport CIESM, 24 (4): 141-142

[2] Gallardo T., Gómez Garreta, A., Ribiera, M.A., Cormaci, M., Furnari, G., Giaccone, G., Boudouresque, C.-F., (1993). Check-list of Mediterranean Seaweeds, II. Chlorophyceae Wille s.l.. Botanica Marina 36: 399-421 https://eurekamag.com/research/008/304/008304313.php

[3] Ribera M.A., Gómez-Garreta A., Gallardo T., Cormaci M., Furnari G., Giaccone G., (1992). Check-list of Mediterranean seaweed. I. Fucophyceae (Warming, 1884). Botanica Marina 35: 109-130. https://www.researchgate.net/profile/Giovanni_Furnari/publication/249926682_Check-list_of_Mediterranean_Seaweeds_I_Fucophyceae_Warming_1884/links/53f3461b0cf2dd48950ca013/Check-list-of-Mediterranean-Seaweeds-I-Fucophyceae-Warming-1884.pdf

[4]Athanasiadis A., (1987). A survey of the seaweed of the Aegean Sea with taxonomic studies on the species of the tribe Antithamnieae (Rhodophyta). Ph.D. Thesis, University of Götenburg, 174 pages.http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=SE882021288

Σε κάθε λιβάδι Posidonia oceanica που παρακολουθείται στο πλαίσιο της ΟΠΥ πραγματοποιούνται δειγματοληψίες με αυτόνομη κατάδυση σε ένα μόνιμο σταθμό στα 15 ± 1 m βάθος. Τα δείγματα μεταφέρονται στο Εργαστήριο Φυτοβένθους του ΕΛΚΕΘΕ για περαιτέρω ανάλυση.

Σε κάθε δειγματοληψία καταγράφονται/μετρούνται οι παρακάτω παράμετροι: Κατώτερο όριο εξάπλωσης (Lower limit depth, m), Τύπος κατώτερου ορίου (Lower limit type: progressive, stable, regressive), Πυκνότητα βλαστών (Shoot density, shoot m-2). Στο εργαστήριο υπολογίζονται οι παράμετροι: Φυλλική επιφάνεια ανά βλαστό (Shoot leaf surface, cm² shoot-1) και Λόγος Βιομάζας Επιφύτων / Βιομάζα Φύλλων (Epiphytic biomass / Leave biomass).

Επιπλέον, σε επιλεγμένα λιβάδια στο πλαίσιο της ΟΠΥ μετρούνται σε κάθε δειγματοληψία οι εξής σημαντικές δημογραφικές παράμετροι: Κάλυψη Λειμώνα (Meadow Cover, %), Κάλυψη νεκρού matte (Dead matte cover, %), Πλαγιότροπα ριζώματα (Plagiotropic rhizomes, %), Ταφή ριζωμάτων (cm from sediment to leaf sheath), Μήκος βλαστού (Shoot length; mm).

Οι δειγματοληψίες μακροζωοβένθους στα παράκτια ύδατα πραγματοποιούνται με το ερευνητικό σκάφος του ΕΛΚΕΘΕ “ΦΙΛΙΑ”. Σε κάθε σταθμό συλλέγονται δύο επαναληπτικά δείγματα για την ανάλυση της βενθικής πανίδας. Ένα επιπλέον δείγμα συλλέγεται σε κάθε σταθμό για προσδιορισμό οργανικού άνθρακα και ολικού αζώτου στο ίζημα, με στοιχειακό αναλυτή CHNS FLASH 2000 Thermo Scientific. Τα προς ανάλυση δείγματα του ζωοβένθους κοσκινίζονται στο πλοίο από κόσκινο διαμετρήματος 1 mm και συντηρούνται σε διάλυμα φορμαλδεΰδης σε θαλασσινό νερό τελικής συγκέντρωσης σε φορμόλη 4%. Στο διάλυμα προστίθεται και χρωστική Rose Bengal.

Στο εργαστήριο γίνεται διαλογή των οργανισμών από το ίζημα και, με τη βοήθεια στερεομικροσκοπίου και ταξινομικών κλειδών, η πανίδα των μακροασπονδύλων ταξινομείται σε επίπεδο είδους, ή, όπου αυτό δεν είναι δυνατό, σε ανώτερο ταξινομικό επίπεδο οικογένειας, γένους ή φύλου.               

Η συλλογή των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών του νερού (θερμοκρασία, αλατότητα, θολερότητα και διαλυμένο οξυγόνο / μετρημένο ηλεκτρονικά) πραγματοποιείται με πόντιση του αυτογραφικού οργάνου CTD (conductivity, temperature, depth), τύπου SBE-9 της Sea Bird Electronics, το οποίο παρέχει συνεχή καταγραφή των χαρακτηριστικών του νερού κατά την πόντισή του από την επιφάνεια έως τον πυθμένα. Η θερμοκρασία αναφέρεται σε βαθμούς Κελσίου και η αλατότητα σε επί τοις χιλίοις περιεκτικότητα σε αλάτι. Η μέτρηση της θολερότητας εκφράζεται μέσω του συντελεστή ‘εξασθένησης’ (B.A.C.: Beam attenuation coefficient) συγκεκριμένης δέσμης κόκκινου φωτός που εκπέμπεται από το όργανο και ‘εξασθενεί’, λόγω της απορρόφησης, σκέδασης, κλπ, από τα αιωρούμενα σωματίδια μέσα στο θαλασσινό νερό.

Οι καταγραφές του οργάνου μετατρέπονται σε τιμές συντελεστή ‘εξασθένησης’ του φωτός (BAC) μέσω της εξίσωσης: T= e-ΒAC r, όπου Τ είναι η οπτική διαπερατότητα (light transmission, %), BAC είναι ο συντελεστής ‘εξασθένησης’ του φωτός (m-1) και r είναι το μήκος της οπτικής διαδρομής (m), δηλαδή η απόσταση από φωτεινή πηγή η οποία εκπέμπει το 100% της έντασης ερυθρής φωτεινής δέσμης και ο αισθητήρας της θολερότητας/ διαύγειας καταμετρά το ποσοστό αυτής (light transmission, %) στη συγκεκριμένη οπτική διαδρομή. Η οπτική διαδρομή του οργάνου που χρησιμοποιείται είναι 25 cm. Όσο μεγαλύτερη είναι η οπτική διαπερατότητα τόσο μικρότερο είναι το ΒΑC και τόσο διαυγέστερο είναι το νερό, και αντίστροφα.

Προς κατανόηση των τιμών ΒΑC αναφέρουμε το ακόλουθο εμπειρικό παράδειγμα. Τιμές ΒΑC γύρω στο 0.35 αντιστοιχούν σε συνθήκες διαύγειας του νερού τέτοιες ώστε ο δίσκος Secchi (λευκός δίσκος διαμέτρου 40 cm) είναι ορατός από την επιφάνεια σε βάθος περίπου 15-17 m, ενώ σε τιμές γύρω στο 1.5 ο δίσκος Secchi είναι ορατός σε βάθος το πολύ 3-4 m. Κατ’ αναλογία σε αντίστοιχη εμπειρική συσχέτιση, τιμές οπτικής διαπερατότητας (light transmission, %) γύρω στο 85% αντιστοιχούν σε συνθήκες διαύγειας του νερού τέτοιες ώστε ο δίσκος Secchi είναι από την επιφάνεια ορατός σε βάθος περίπου 4-6 m, ενώ σε τιμές γύρω στο 90-95% ο δίσκος Secchi είναι ορατός σε βάθος περίπου 15-17 m.

ΔΙΑΛΥΜΕΝΟ ΟΞΥΓΟΝΟ ΚΑΙ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΑΛΑΤΑ

Το διαλυμένο οξυγόνο προσδιορίζεται πάνω στο ερευνητικό σκάφος, αμέσως μετά τη δειγματοληψία (Riley, 1975[1]), με τη μέθοδο Winkler τροποποιημένη από τον Carpenter (1965)[2].

Τα δείγματα για την ανάλυση των νιτρικών, νιτρωδών αλάτων συλλέγονται σε γυάλινα φιαλίδια, ενώ τα δείγματα για την ανάλυση των πυριτικών σε φιαλίδια από πολυπροπυλένιο. Τα φιαλίδια είναι προκατεργασμένα με διάλυμα HCl. Τα δείγματα καταψύχονται έως την ανάλυση. Οι αναλύσεις για τον προσδιορισμό των νιτρικών, νιτρωδών και πυριτικών αλάτων γίνονται στη διαπιστευμένη κατά ISO 17025 εργαστηριακή μονάδα θρεπτικών αλάτων του βιογεωχημικού εργαστηρίου του ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε. με αυτόματο αναλυτή θρεπτικών αλάτων BRAN + LUEBBE autoanalyzer III, σύμφωνα με πρότυπες μεθόδους (Mullin & Rilley, 1955[3] για τα πυριτικά, Stickland & Parsons, 1968[4] για τα νιτρώδη – νιτρικά και Murphy & Riley, 1962[5] για τα φωσφορικά). Τα όρια ποσοτικοποίησης των μεθόδων είναι 0.025 μΜ για τα νιτρώδη άλατα, 0.154 μΜ για το άθροισμα νιτρικών και νιτρωδών αλάτων, 0.102 μΜ για τα αμμωνιακά άλατα και 0.274 μΜ για τα πυριτικά άλατα. Οι συγκεντρώσεις που προσδιορίζονται, και είναι μικρότερες των ορίων ποσοτικοποίησης, αναφέρονται ως <LOQ.

Τα αμμωνιακά άλατα προσδιορίζονται μετά τη δειγματοληψία σε ειδικά φιαλίδια, με φασματοφωτόμετρο Perkin-Elmer UV/VIS (Lambda 25Lambda), σύμφωνα με πρότυπες μεθόδους ανάλυσης (Κoroleff, 1970[6]).

[1] Riley, J.P., (1975). Determination of dissolved gases, in Riley J.P. (ed.) Chemical Oceanography, 2nd edition, 3: 253.

[2]Carpenter, J.H., (1965). The Chesapeake Bay Institute technique for dissolved oxygen method. Limnol. Ocean., 10 : 141-143. https://doi.org/10.4319/lo.1965.10.1.0141

[3] Mullin, J.B. & Riley, J.P., (1955). The colorimetric determination of silicate with special reference to sea and natural waters. Anal. Chim. Acta, 12: 162-176. https://doi.org/10.1016/S0003-2670(00)87825-3

[4] Strickland, J.D.H & Parsons, T.R., (1968). A practical handbook of sea water analysis. Bull. Fish. Res. Bd. Canada, 167:310p.

[5] Murphy, J. & Riley, J. P., (1962). A modified single solution method for phosphate in natural waters. Anal. Chim. Acta, 12: 162-176.

[6] Koroleff, F., (1970). Revised version of “Direct determination of ammonia in natural waters as indophenol blue”. Int. Con. Explor. Sea C. M. 1969/ C:9 ICES information on techniques and methods for sea water analysis. Interlab. Rep., No 3, 19-22.

Ο προσδιορισμός του ολικού αζώτου (TN) και του ολικού φωσφόρου (ΤΡ) γίνεται με τη μέθοδο της υγρής χημικής οξείδωσης (wet chemical oxidation method, WCO), όπως περιγράφεται από τους PUJO-Pay & Raimbault (1994)[1] και Raimbault et al. (1999)[2].

Για τον προσδιορισμό του ΤΝ συλλέγονται 40 ml θαλασσινού νερού σε Pyrex φιαλίδια (Duran Schott) των 50 ml με κατάλληλο βιδωτό καπάκι, ενώ για τον προσδιορισμό του ΤΡ συλλέγονται 20 ml θαλασσινού νερού σε κατάλληλα φιαλίδια από Teflon. Τα δείγματα διατηρούνται έως την ανάλυσή τους στους -20 ^οC. Όλα τα φιαλίδια που χρησιμοποιούνται για τη συλλογή/φύλαξη των δειγμάτων υφίστανται προκατεργασία καθαρισμού δύο σταδίων που περιλαμβάνει την πλήρωσή τους με HCl 10% για 24 ώρες, ξέπλυμα και εν συνεχεία προληπτική οξείδωση, για την απομάκρυνση ιχνών οργανικής ύλης. Το περιεχόμενο των φιαλιδίων απορρίπτεται τη στιγμή της δειγματοληψίας και τα φιαλίδια ξεπλένονται πολύ καλά με το δείγμα.

Σύμφωνα με την αρχή της μεθόδου επιτυγχάνεται οξείδωση των αζωτούχων και φωσφορούχων ενώσεων και μετατροπή τους σε ανόργανα διαλυτά νιτρικά και φωσφορικά άλατα, αντίστοιχα, οπότε τα δείγματα, μετά τη διαδικασία της υγρής χημικής οξείδωσης, μετρούνται σε αυτόματο αναλυτή θρεπτικών αλάτων BRAN+LUEBBE autoanalyzer III, σύμφωνα με τις μεθόδους που αναφέρονται παραπάνω για νιτρικά+νιτρώδη και φωσφορικά αντίστοιχα.

[1]Pujo-Pay, M. & P. Raimbault, (1994). Improvement of the wet-oxidation procedure for simultaneous determination of particulate organic nitrogen and phosphorus collected on filters. Mar. Ecol. Prog. Ser. 105, 203-207. https://pdfs.semanticscholar.org/2c64/17f3a2d0564b7917b60fb0ed79c1ceda7f2d.pdf

[2] Raimbault, P., W. Pouvesle, F. Diaz, N. Garcia, R. Sempere, (1999). Wet oxidation and automated colorimetry for simultaneous determination of organic carbon, nitrogen and phosphorus dissolved in seawater. Marine Chemistry 66, 161-169. https://doi.org/10.1016/S0304-4203(99)00038-9″

Η ποσότητα του ολικού άνθρακα στα ιζήματα προσδιορίζεται με ένα CHN στοιχειακό αναλυτή τύπου EA-1108 της «Fisons Instruments», με την ακρίβεια της μεθόδου να καθορίζεται στο 5% της μετρηθείσας τιμής. Ο επιμέρους οργανικός άνθρακας προσδιορίζεται σύμφωνα με τη μέθοδο των Verardo et al. (1990)[1], με το όριο ανίχνευσης της μεθόδου να είναι 2.3 mg/g ανά 10 mg ξηρού δείγματος.

[1] Verardo, D.J., Froelich, P.N. & McIntyre, A., 1990. Determination of organic carbon and nitrogen in marine sediments using the Carlo Erba NA-1500 Analyser. Deep-Sea Res., 37 (1), 157-16. https://doi.org/10.1016/0198-0149(90)90034-S